远志科研团队培训一大鼠脑梗塞模型

一、相关知识简介

缺血性脑血管病是目前发病率、致残率和死亡率较高的严重疾病之一，其防治已成为亟需解决的重大临床课题。动物模型是医学研究中的一个重要手段，尤其对于缺血性脑血管病，能即刻制造或模拟血流下降或阻断，只有利用动物模型才能进行。一种理想的脑缺血动物模型应该具备与临床情况相类似、可重复性、避免复杂的副反应且容易操作等特点。

但一般情况下，活体动物模型的制作多采用健康动物，缺乏人脑缺血前就存在的各种复杂的危险因素和病理生理学过程。尽管如此，脑缺血动物模型在以下几个方面还是为研究提供了无法替代的价值：(1)不同脑缺血状态下的病理学改变；(2)缺血半暗带的研究；(3)再灌注损伤；(4)缺血本身导致的病理生理学变化；(5)干预治疗对缺血性损害的保护作用；(6)缺血性损害的部分机制。

目前复制脑缺血动物模型的方法已有十几种之多，各有其优缺点，据实验目的的不同应选择适当得脑缺血模型。常用实验动物有沙土鼠、大鼠、家兔、小鼠、狗、猫等，其中啮齿类动物因其价格便宜、来源充足、制作模型方法简单、存活率高、脑血管解剖和生理接近于人类，故被广泛用作脑缺血及缺血再灌注模型。

二、常用脑梗塞动物模型

1大鼠脑梗塞模型

大鼠的神经系统与人相似，脑血管变异少，价廉、易得、易饲养，是目前最常用的脑梗死模型动物。

1.1全脑缺血模型

1.1.1双血管闭塞法

该模型由Eklof和Nordstrom首先建立，用以研究不完全性脑缺血对能量代谢的影响，通过阻断大鼠双侧颈总动脉和降低血压共同完成。大鼠低血压可通过尾动脉放血或使用降压药(三甲噻方或酚妥拉明)将血压降至50mmHg实现，其优点是手术简单，一次性实施，且可人为控制动物的呼吸；其缺点包括：(1)仅能形成不完全性脑缺血；(2)由于全身性低血压会严重干扰其他脏器的血供和实验结果；(3)无法观察动物的神经行为学变化。

1.1.2三血管闭塞法

三支动脉阻断法即结扎延髓腹侧面上的基底动脉，并通过阻断与开放双侧颈总动脉，实现全脑缺血一再灌流，最早由Kameyama建立。在制备过程中必须同时监测呼吸与血压。与四血管阻断法相比较，该法前脑缺血更为完全，成功率更高，缺血指标明确而简单，能够通过阻断颈总动脉时间的长短控制脑缺血程度，可用于评价脑缺血易损区，特别是海马神经元的损伤和保护机制。但是，手术操作比四血管阻断法更为复杂且易损伤脑干，动物死亡率高达50%以上，且存活时间短。

1.1.3四血管闭塞法

Pulsinellilv于年首先报道了采用电凝固大鼠双侧椎动脉合并结扎双侧颈总动脉，一定时间后再解除两侧颈总动脉结扎进行再灌注，从而造成严重大脑缺血再灌注损伤这种具有高度可重复性的全脑缺血造模方法。李兵等对传统的四血管闭塞法进行了改良，在阻断双侧椎动脉后夹闭双侧颈总动脉，以出现静息脑电波为判定大鼠已达全脑缺血的标准，而非传统的以大鼠翻正反射消失和眼球变白为标准，结果表明模型制作的成功率明显提高。该法的优点是可较好地模拟临床上因低血压休克、心肺脑复苏等造成全脑缺血性损伤过程；不足之处在于操作相对复杂、不能一次完成，动物的死亡率高，且因椎动脉与脊髓前动脉间有交通支的影响，缺血效果不明显，同时易引起惊厥，稳定性亦较差。此法亦为目前国际公认的血管性痴呆模型制备方法，也可用于神经保护药的研究。

1.2局灶性脑缺血模型

临床上，缺血性脑血管病多为局灶性，以大脑中动脉(MCA)闭塞(MCAO)多见。因此，制作MCA缺血并且可实现再灌注的动物模型更接近临床。MCAO模型被公认为标准的局灶性脑缺血动物模型。

1.2.1线栓法

该法最早由Koizumi首先报道。制作方法为:先阻断颈外动脉及其分支和颈内动脉的分支翼愕动脉，以切断颅外来源的侧副循环血流。从颈外动脉插入尼龙线，经颈内动脉到大脑前动脉，以阻断MCA发出处的血供。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可有效避免实验结果的不稳定性。由于其模拟了人缺血性脑血管病的永久性和暂时性局灶性脑缺血的各种状态，在评价再灌注损伤的作用以及药物疗效方面更具有说服力。

1.2.2开颅法

该法由Tamura和Bederson首先应用，后来Kader通过电凝闭塞MCA的所有可见分支而获得良好的梗死效果。另外，眶后人颅法阻断MCA也较为常用，以Oawner手术最为经典，其操作方法是在直视下将MCA结扎或电凝，或应用套线或微动脉夹制作脑缺血再灌注模型。此方法成功率较高，是目前获得梗死灶最可靠而且缺血效果最好的MCAO模型，也是目前国际上最常应用的脑缺血模型之一；对全身影响较小，动物存活时间长；能够模拟人一侧大脑半球缺血性梗死。该模型适用于脑缺血后长期神经运动功能缺损的康复策略以及干预治疗的研究。其不足之处包括：(1)可能对邻近的脑组织产生损伤；(2)形成潜在的脑脊液漏；(3)对血管的过多操作以及继发性血管痉挛可影响缺血后侧支循环功能；(4)损害咀嚼功能，从而影响术后动物的进食；(5)需要有较熟练的显微外科技术等。

1.2.3化学刺激诱导法

国内刘小光按照Tamura的方法开颅显露位于嗅束和大脑下静脉之间的一段MCA，将吸有50%三氯化铁溶液的小片定量滤纸贴于该段血管上并保留30min，术后24h可形成由血小板、红细胞和纤维蛋白组成的混合血栓。该模型的梗死范围和行为障碍特征与Tamura建立的局灶性脑缺血模型一致，但存在需开颅手术和不能再灌注的缺点。该法既能反映抗栓药又能反映溶栓药的药效，为抗血栓药的筛选研究提供了较好途径。但是由于暴露MCA时动物的颧弓被去除，以致于影响动物的进食，因此若用于长期观察还有待改进。

1.2.4光化学诱导法

该模型适用于抗血小板药的筛选以及慢性脑缺血的研究。其原理是通过在大鼠尾静脉注射光敏材料虎红酸钠，暴露颅骨后用冷光源照射局部头颅，激发光化学反应引起皮质缺血性坏死，缺血范围只涉及背外侧纹状体，海马、丘脑和其他基底节区等皮质下结构不受累。该模型的优点包括：(1)与人血栓形成性脑梗死的发病过程较为相似；(2)方法简单，通过控制光源的强度、时间和药物剂量控制脑梗死的部位、范围和深度，重复性好；(3)在光化学诱导血栓形成过程中，由于同时启动了缺血性脑损伤和凝血纤溶系统，因此脑组织病理学损害程度较其他脑缺血动物模型更为严重。不足之处为：(1)光敏物质对血液系统有影响；(2)微血管明显损伤、血脑屏障早期开放、血管源性脑水肿均为大血管闭塞的非典型表现，而非人脑血栓形成的表现特征；(3)由于动脉末端阻断，使得该模型不适用于侧支循环药物疗效的评价；(4)模型制作需要特殊设备。

2兔脑梗塞模型

兔脑梗塞模型具有如下优点：(1)兔性情温驯，易于饲养，体质量较大，便于操作；(2)兔的脑血管类型比狗、猫更接近于灵长类；(3)血管操作易于完成，部位较恒定，重复性好；(4)手术后死亡率低，存活时间长，便于进行较长时间的观察；(5)取血容易且血量较多，可进行多项指标的检测和动态观察；(6)兔脑大小适中，便于同时进行多项生化指标的观察；(7)血管粗大且暴露，可进行夹闭后的再灌注实验。不过，兔的颈动脉系统解剖变异性很大，提高对其解剖结构变异的认识对制作模型相当重要。目前，兔脑缺血模型主要通过介入微导丝法、自体微血栓法、经眶入路法、经眶后入路法和导管法引入栓子栓塞供血动脉等方法制作。

三、小结

综上所述，脑缺血动物模型为脑缺血发生发展机制以及干预措施等方面的研究提供了重要的手段。但是各种脑缺血模型各有利弊，在实际应用时根据不同的目的、条件选用最适合的方法，也可以在此基础上有所改进，同时注意对动物生理学、生物化学、形态学、神经行为学的监控，这是建立标准化脑缺血动物模型的前提和基本条件。此外，我们应当注意到动物模型不可能真正反映人类脑缺血情况，在研究中我们应尽量模拟人类脑缺血的病理状态。

本次培训，团队采用的是线栓法制备大鼠脑梗塞动物模型（详见上文红色加粗字段）。以下是团队培训过程中的实验操作图片。

图1大鼠颈部正中切口

图2切开

图3钝性分离

图4钝性分离

图5分离暴露气管

图6在气管右侧找到右颈总动脉

图7分离右颈总动脉

图8找到颈总动脉分叉处

图9将栓塞线插入动脉，结扎

图10松开一个动脉夹，将栓塞线沿颈内动脉继续深入

图11测量残留在动脉外的栓塞线长度，计算栓塞深度

图12脑梗塞模型造模成功后开颅取脑

图13大鼠大脑

图14互相配合

图15互相学习

PS：团队下次将会进行大鼠去卵巢（骨质疏松）动物模型的制备培训。