Nature重磅昼夜节律的临床意义对神经
2020-8-24 来源：本站原创 浏览次数：次北京中科白癜风出席健康中国公益盛典 http://disease.39.net/yldt/bjzkbdfyy/6109746.html
年6月哈佛医学院EngH.Lo教授于Nature发文Potentialcircadianeffectsontranslationalfailureforneuroprotection其研究证明了一个事实，在脑卒中和中枢神经系统疾病的转化研究中，必须考虑昼夜节律对神经保护的影响。
图1：脑卒中鼠模型中
的神经保护作用
昼夜节律影响疾病机制和对治疗的反应。几乎所有针对中风的神经保护剂的实验测试都是在白天进行的，那时啮齿动物通常是活动的。相比之下，由于需要确定发病时间，临床试验主要招募白天（活动期）发生中风的患者。在涉及名患者的缺血性中风神经保护的五个大型临床试验中，只有名患者夜间中风（10.00p.m.到7.00a.m.）。因此，作者研究了动物模型是否模拟非清醒期（非活动期）中风，而临床试验测试清醒期（活动期）中风的神经保护作用（图1a）。作者首先评估了常压高氧（NBO），这是一种在啮齿动物身上有效的治疗方法，但在临床试验中没有成功。雄性Sprague–CDawley大鼠在大脑中动脉（MCAO）短暂闭塞min后，用%O2（NBO）或30%O2（对照组）进行治疗，并在闭塞24小时后取出大脑。当在白天进行实验时（非活动期；zeitgebertime（ZT）3-9），NBO减少了梗死（图1b）。然而，当实验在夜间进行时（活跃期；ZT15–C21），NBO并没有减少梗死（图1b）。作者注意到，在活动期诱发的梗死灶往往更小。因此，缺乏神经保护的一种可能性可能是因为梗死已经很小，而且没有进一步的保护。为了控制这种情况，作者用一个不太严重的60分钟短暂性缺血模型重复了这些实验。未经治疗的梗死现在甚至更小，但NBO仍然能够减少ZT3-9的梗死（图1c）。NBO实验的一个警告是，操作者并没有对白天和晚上的小组视而不见，而且有可能在夜间手术时操作者的表现下降。为了解决这些问题，动物们被关在一个正常或相反的光照时间安排的房间里三个星期，然后所有的手术都是在白天进行的，操作人员对光照时间表视而不见。手术由不同的操作者进行，使用不同的物种，并测试不同的神经保护剂。C57BL/6雄性小鼠经短暂MCAO处理60min，再灌注后即刻用自由基清除剂αPBN5或载体治疗，再灌注后2h。在非活动期（ZT3–C9）而非活动期（ZT15–C21）手术小鼠的梗死体积（三天后测量）减小（图1d）。为了评估这些结果的普遍性，作者使用不同的模型和神经保护剂进行了第三系列实验。C57BL/6小鼠，来自光线正常或相反的房间经大脑中动脉远端凝血、切断造成永久性缺血。在缺血发作前，用NMDA受体拮抗剂MK或载体1h治疗小鼠。MK减少了在非活动期（ZT3–9）而非活动期（ZT15–C21）小鼠3天的梗死体积（图1e）。生理参数，包括pH、pO2、pCO2、葡萄糖和胰岛素水平，在各组之间相似，并在与脑缺血模型一致的范围内。综上所述，三种机械独立、实验证实但临床上失败的神经保护剂都在ZT3-9中起作用，但在ZT15-21模型中却不起作用。这些结果表明，在活跃的啮齿类动物模型中，神经保护可能更难实现，这些模型更类似于通常招募到临床中风试验的患者（白天中风）。与神经保护策略的失败相比，临床试验的结果对溶栓和血栓切除术是积极的，这意味着再灌注是一种对清醒（活动）和非清醒（非活动）中风都有效的治疗方法。将来自光照正常或相反的房间的C57BL/6小鼠进行MCAO，然后随机分为永久性缺血或60分钟短暂性缺血。在这个“阳性对照”实验中，在ZT3-C9或ZT15-C21中，再灌注降低了小鼠24小时的梗死体积（图1f）。昼夜节律周期可能影响止血途径10。因此，作者检测了组织纤溶酶原激活剂（tPA）的溶栓能力。在ZT3–C9和ZT15–C21小鼠血液中，tPA凝块溶解率没有显著差异。虽然作者的研究试图涵盖多个模型和靶点，但必须承认药物特异性和模型特异性效应的重要性。例如，作者考虑了通过改善再灌注损伤，αPBN可以不同程度地影响活动和非活动小鼠的再灌注血流。作者将C57BL/6小鼠置于60分钟短暂性局灶性缺血，再灌注后立即给予ωPBN或溶媒治疗。激光多普勒血流测量显示，所有组的再灌注曲线无显著差异。对于MK，神经保护可通过低温介导。为了验证MK对活跃和不活跃小鼠体温的影响是否存在差异，作者用MK或载体治疗C57BL/6小鼠，然后阻断大脑中动脉远端。没有各组直肠温度有显著差异。因此，在作者的动物模型的检测范围内，作者观察到的αPBN和MK的昼夜节律差异可能不会因再灌注或温度变化而受到干扰。
图2：局灶性脑缺血半暗区
比较。
神经保护的概念性靶点。它由部分维持血流的区域组成，因此神经元可以短暂存活。因此，作者的结果可能有两个潜在但并非相互排斥的原因——当动物清醒和活动时，半影较小和/或对缺血和神经保护的反应不同。为了评估第一种可能性，作者让C57BL/6小鼠从正常或反向光照的房间进入局灶性缺血，然后在闭塞后25分钟进行激光散斑成像。所有动物的血压和pCO2没有显著差异。正如预期的那样，同侧皮质有血流梯度，从中线附近的正常水平到病灶核心的缺血水平（图2a）。然而，与ZT5-7小鼠相比，ZT17-C19小鼠的灌注梯度更陡（图2a，b）。ZT17-C19小鼠的缺血半暗带比ZT5-7小鼠窄（图2b，c）。如果不进行有效的治疗，半影会塌陷，梗死灶会扩大。因此，小半影的另一个推论是中风发作后进行性细胞死亡和梗死灶生长减少。作者将雄性C57BL/6小鼠从光线正常或相反的房间进入60分钟短暂性局灶性缺血。正如预期的那样，梗塞体积在闭塞后12-72h之间增加，但是ZT15-C21小鼠的梗死面积增长率与ZT3-C9小鼠相比有所降低（图2d），与较小的半暗带一致。缺血后24小时，ZT15-C21梗死灶周围TUNEL阳性细胞密度及TUNEL/fluoro-jade阳性神经元比率均低于ZT3-9半暗带（图2e，f）。这些结果表明，在ZT15-C21期间闭塞的小鼠脑卒中模型中，有一个较小的半暗带，细胞死亡较少，梗死灶生长减少。这些发现间接地表明，在神经保护试验中，与白天中风患者相匹配的活动性啮齿类动物模型可能“治疗空间”较小。中央昼夜节律控制在视交叉上核，但昼夜节律也可能发生在皮质。作者解剖了取C57BL/6小鼠和SpragueCDawley大鼠的体感皮层，用PCR和反转录（RTCPCR）方法检测有代表性的昼夜节律基因的表达。作者的数据证实，在这一通常受中风影响的区域，小鼠和大鼠的昼夜节律基因的时间分布似乎与人类和非人类灵长类动物大脑中发现的情况相反，这与啮齿动物夜间活动的事实相一致。
图3：昼夜节律周期对OGD反应和神经保护的
效应
因此，作者研究了昼夜节律是否也直接影响神经元对缺血的易感性和对神经保护的反应。作者使用地塞米松来触发小鼠皮层神经元Per1和Per2表达的昼夜节律周期（图3a）。这些周期使作者能够模拟在活性期（地塞米松后6h，高Per1和Per2）或不活跃期（12h地塞米松后，低Per1和Per2）进行的体内实验。作者剥夺了神经元的氧和葡萄糖，在氧-葡萄糖剥夺（OGD）期间用αPBN或MK处理细胞，使其重新充氧24小时，然后进行细胞活性测定以量化神经保护（图3b）。缺氧和缺糖3h可导致30～40%的神经元细胞死亡。虽然作用大小很小，但αPBN和MK似乎能显著降低“非活动期”啮齿动物神经元的细胞死亡，而不是“活跃期”的细胞死亡（图3c，d）。由于保护“活跃期”神经元比“不活跃期”神经元更困难，作者在这些神经元中寻找靶向机制的差异。OGD后，谷氨酸释放和活性氧（ROS）水平增加。然而，这些增加在“活跃”的神经元中比在“不活跃”的神经元中要小（图3e），这表明兴奋性毒性和氧化应激可能不那么突出，因此在“活跃”的啮齿动物神经元中也不那么重要。接下来，作者研究下游细胞死亡机制，包括凋亡和坏死。OGD诱导caspase-3和RIP3激酶的激活，但这些反应在“活跃”的啮齿动物神经元中也比“不活跃”的神经元小（图3f-h）。脑缺血后，神经元通过细胞死亡的被动和主动模式死亡。前者是一种“耗散性”细胞死亡，发生在严重的氧和葡萄糖损失后，导致代谢崩溃。这些过程可能发生在核心，只有迅速恢复丢失的能量基底才能被阻断。第二种是一种“主动”模式，它吸收上游兴奋性毒性和氧化应激，以及下游的凋亡和坏死性下垂。这种类型的细胞死亡是分子神经保护的概念目标，大概在半影内。因此，作者的体外实验结果可能与体内研究结果一致，即ZT15–C21比ZT3–C9中风模型的活跃细胞死亡和梗死灶生长减少，这意味着ZT15–C21啮齿类动物模型的“靶向性损伤”应该更少，与白天中风患者相匹配。最后进行了一个概念验证实验来检验这种对神经保护的抵抗力。虽然不可能阻止一切，但作者试图尽可能多地覆盖主动细胞死亡：作者使用MK阻断NMDA兴奋毒性，2,3-二氧-6-n-硝基-7-氨磺酰苯并[f]喹诺酮酸（NBQX）阻断AMPA（|α-氨基3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸）兴奋毒性，αPBN阻断ROS，zVAD-fmk阻断细胞凋亡，坏死抑制素-1阻断坏死下垂，在接受3小时OGD和24小时复氧的神经元中。与观察到的活跃细胞死亡的差异一致，“活跃”的啮齿动物神经元对神经保护的抵抗力（即阻断这些主要活性细胞死亡靶点后的剩余损伤）大于“不活跃”的啮齿类神经元（图3i）。作者的发现指出了目前使用的神经保护啮齿动物模型和人类中风患者之间的根本区别。临床试验在活跃、清醒的病人身上测试神经保护剂，而啮齿动物试验是在白天进行的，当他们不活动的时候。然而，必须牢记一些注意事项。首先，昼夜节律差异不是翻译失败的唯一原因。啮齿类动物模型的其他方面，包括年龄、高血压和代谢性疾病，也与临床人群不符。事实上，自由基自旋陷阱NXY-在狨猴身上得到了成功的测试（在一个实验室的两个研究中），但在临床试验中仍然失败。研究如何与未来的昼夜节律相互作用。第二，作者的研究表明，昼夜节律影响半影，但这种影响的潜在机制仍不清楚。昼夜节律如何影响正常组织和缺血组织中的神经-血管耦合，应该探讨。第三，作者显示了昼夜节律对OGD反应的影响。需要进一步的研究来剖析生物节律基因和细胞存活或死亡基因之间的串扰是如何调节神经保护的。第四，作者的体内实验集中在梗死。这种方法对促进恢复的药物无效，因此研究昼夜节律如何与神经可塑性相互作用是很重要的。第五个问题是压力。尽管所有组均采用统一的处理方法，且皮质醇没有可检测的差异，但昼夜节律的差异也可能涉及活动和非活动啮齿类动物不可避免的压力差异。最后，昼夜节律生物学可能与中风病理生理学的多个方面相互作用，包括胶质细胞反应、细胞因子和趋化因子、内皮或止血机制、免疫反应、温度调节、血脑屏障和药物传递或代谢。必须研究这些系统在活跃和不活跃的啮齿动物模型中的差异。
脑卒中患者神经保护试验的失败导致了该领域的一些悲观情绪。然而，最近在血栓切除和再灌注方面取得的成功，已经有人呼吁恢复寻求。作者的研究结果表明，为了向前发展，中风机制在啮齿类动物模型中，应在适当的昼夜环境下对目标进行重新评估。原文链接：
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